.
یک دهه پیش، یینگ ژانگ خود را در آستانه یک انقلاب پزشکی یافت.
ژانگ یکی از نخستین دانشمندانی بود که شرکت کریسپر تراپیوتیکس در شهر زوگ سوئیس استخدام کرد. این شرکت زیستفناوری در سال ۲۰۱۳ برای درمان بیماری با استفاده از ویرایش ژن کریسپر–کاس۹ تأسیس شد. این تکنیک تازه منتشر شده بود و ژانگ و همکارانش در رؤیای راههایی برای بهکارگیری این ابزار نوآورانه بودند.
اما او بهزودی دلسرد شد. بسیاری از برنامههایش نیازمند جایگزینی یک ژن معیوب کامل با نسخهای سالم بود — و او بهسرعت آموخت که این کار با کریسپر–کاس۹ چالشبرانگیز است. ژانگ میگوید: «وقتی نخستین بار به آنجا رسیدیم، سرشار از هیجان بودیم. و وقتی واقعاً همه کار را انجام دادیم، دریافتیم که پیچیدهتر از آن است که فکر میکردیم.»
امروز آسانتر است. ژانگ که اکنون در دانشگاه ووهان چین است، و دیگران در این حوزه، در حال توسعه مجموعهای بهسرعت در حال رشد از ابزارها برای بازنویسی ژنوم هستند، چه برای درمان و چه برای پژوهش پایه. برخی روشها بر کریسپر–کاس۹ بنا شدهاند؛ برخی دیگر کاملاً از آن رها شدهاند. شانون میلر، مهندس زیستی در مؤسسه تحقیقات اسکریپس در لا هویا، کالیفرنیا، میگوید: «انفجاری دیوانهوار از فناوریهای جدید رخ داده است.»
این تکنیکها هنوز در روزهای نخست خود هستند و هر یک مزایا و معایبی دارند. هیچکدام سادگی و تطبیقپذیریای را که کریسپر–کاس۹ به وظایف ویرایش DNA فروتنانهتر آورد، نشان ندادهاند. انتخاب اینکه کدام روش به کار رود به اندازه DNA مورد درج، محل درج در ژنوم و نوع سلولی که اصلاح میشود بستگی دارد (نگاه کنید به «راهنمای کوتاه ویرایش بزرگ ژن»). امی پولر، رئیس بخش درمانهای عصبی در رگنرون در تریتاون، نیویورک، میگوید: «طعمهای بسیار متفاوتی وجود دارد. این رویکردی یکاندازهبرایهمه نخواهد بود.»
انتخاب ابزار مناسب برای کار
فناوریهای ویرایش ژن کریسپر–کاس۹ که راحت و تطبیقپذیر هستند، واقعاً زمانی میدرخشند که برای ایجاد تغییرات کوچک در توالی DNA بهمنظور از کار انداختن عملکرد یک ژن به کار میروند. تکنیکی مرتبط و دقیقتر به نام ویرایش باز، از ماشین کریسپر برای تغییر «حروف» منفرد DNA بهره میگیرد.
هر دو تکنیک برای درمان بیماری در انسان به کار رفتهاند، اما محدودیتهایی دارند. ابزارهای ویرایش ژن کریسپر–کاس۹ باید پیش از تغییر DNA آن را بشکنند. آنزیم کاس۹ هر دو رشته DNA را در محل هدف میبرد و پژوهشگران به ماشین ترمیم طبیعی — و مستعد خطا — سلول تکیه میکنند تا شکاف را ببندد. نتایج این ویرایشها میتواند غیرقابل پیشبینی باشد و اغلب ژن را از کار میاندازد.
و ویرایش باز باید برای DNA هر فرد تنظیم شود، که آن را برای برخی بیماریها بیش از حد دقیق و غیرعملی میکند. برای مثال، بیماری اشتارگارت، که نوعی از دست دادن ارثی بینایی است، میتواند ناشی از هر یک از بیش از ۱٬۲۰۰ واریانت ژن ABCA4 باشد که حدود ۷۵۰ مورد از آنها با ویرایش باز قابل اصلاح است. اما برای درمان همه آنها صدها درمان ویرایش باز متمایز لازم است. ژانگ میگوید: «توسعه دارویی که فقط یک بیمار دارد واقعبینانه نیست. اگر بتوانید کل ژن سالم را نصب کنید، حداقل میتوانید یک اختلال ژنتیکی را با یک درمان پوشش دهید.»
برخی پژوهشگران امیدوارند از درجهای بزرگ ژن برای بخشیدن عملکردهای تازه به سلولها استفاده کنند. این تکنیک میتواند برای مثال به درمانهای سلول T با گیرنده آنتیژن کایمریک (CAR) توانایی تولید پروتئینهای تحریککننده ایمنی یا کلیدهای ژنتیکی را بدهد که سلولها را فقط زمانی فعال میکنند که نزدیک تومور باشند.
علاوه بر این، دانشمندانی که پژوهش پایه انجام میدهند میتوانند قطعات بزرگ DNA را دستکاری کنند تا مدلهای بهبودیافتهای از بیماریهای انسانی بسازند، مسیرهای متابولیک را بازتولید کنند، روابط ساختار–عملکرد ژنومی را بررسی کنند و کروموزومهای مصنوعی بسازند.
با این حال، کریسپر–کاس۹ همیشه ابزار درستی برای دستیابی به این اهداف نیست. میتواند DNA را درج کند، اما کارایی آن با بزرگتر شدن قطعه کاهش مییابد، بنابراین پژوهشگران معمولاً آن را با قطعات DNA کوتاهتر از ۲٬۰۰۰ جفتباز به کار میبرند. این تکنیک همچنین ممکن است در سلولهایی که فعالانه تقسیم نمیشوند، مانند نورونها، دشوار باشد. تکنیک دیگری مبتنی بر کریسپر به نام ویرایش پرایم میتواند توالیها را بدون شکستن هر دو رشته DNA درج کند، اما تنها چند صد باز را میپذیرد. بین لیو، که تکنیکهای ویرایش ژن را در دانشگاه ایالتی اوهایو در کلمبوس توسعه میدهد، میگوید: «این واقعاً یک گلوگاه برای این حوزه است.»
یک بسته کوچک
برای رفع این گلوگاه، پژوهشگران عناصری از ابزارهای ویرایش ژن کریسپر را با آنزیمهای دیگری ترکیب کردهاند که قادر به دوختن قطعات بزرگ DNA در ژنوم هستند. برای مثال، مهندسان ژنوم عمر ابودیه و جاناتان گوتنبرگ در دانشکده پزشکی هاروارد در بوستون، ماساچوست، روشی توسعه دادهاند که از آنزیمی بهره میگیرد که قادر به دوختن دهها هزار باز DNA در ژنوم است1.
آن آنزیم، به نام اینتگراز بزرگ سرینی، DNA را در محلهای مشخص بدون نیاز به شکستن دو رشته DNA درج میکند. ابودیه و گوتنبرگ از اینتگرازی به نام Bxb1 استفاده میکنند. آنها از ویرایش پرایم برای معرفی محلها (به نام پدهای فرود) و پروتئین کاس۹ متصل به Bxb1 برای درج DNA استفاده میکنند. این تیم تکنیک را PASTE نامیدند.
.
پژوهشگران در شرکت اکنون تعطیلشده تام بیوساینسز در واترتاون، ماساچوست، که ابودیه و گوتنبرگ همبنیانگذاران آن بودند، از گونهای از PASTE در میمونهای سینومولگوس (Macaca fascicularis) برای جایگزینی ژنی استفاده کردند که با هموفیلی B، یک بیماری خونی انسانی، مرتبط است2. پژوهشگران گزارش دادند که حدود نیمی از سلولهای کبد حیوانات پس از یک درمان واحد حاوی نسخه اصلاحشده بودند.
اما PASTE نیازمند چندین عنصر است: آنزیم کاس۹ اصلاحشدهای که یک رشته DNA را در محل هدف میبرد یا شکاف میزند؛ توالی پد فرود؛ یک رونوشتبردار معکوس که پد فرود را در ژنوم کپی میکند؛ اینتگراز؛ یک RNA راهنما؛ و DNA اهداکننده.
برای رساندن همه این عناصر به سلولها در آزمایشهای میمون، پژوهشگران از دو روش تحویل استفاده کردند: نانوذرات لیپیدی که mRNA کدکننده آنزیمها و RNA راهنما را حمل میکردند؛ و ویروسی به نام ویروس مرتبط با آدنو یا AAV که حاوی DNA اهداکننده و توالی پد فرود بود. ابودیه میگوید: «این پیچیدگیها روی هم جمع میشوند. ما در کبد به ۵۰ درصد رسیدیم، اما هدفگیری هر اندام دیگری بسیار چالشبرانگیز میشود.»
.
روشهای دیگر حتی پیچیدهترند. برای مثال، عناصر DNA متحرکی به نام ترانسپوزونها را در نظر بگیرید. بسیاری از ترانسپوزونها با کمک آنزیمهایی به نام ترانسپوزاز میتوانند خود را با ظاهری تصادفی در DNA درج کنند. اما ترانسپوزازهای مرتبط با کریسپر (CASTs) میتوانند در صورت دریافت RNA راهنما و DNA اهداکنندهای که در دو انتهایش توالیهای ترانسپوزون دارد، محل مشخصی در ژنوم را هدف بگیرند.
سام استرنبرگ، بیوشیمیدان دانشگاه کلمبیا در شهر نیویورک، و دیوید لیو، زیستشناس شیمی در مؤسسه برود وابسته به MIT و هاروارد در کمبریج، ماساچوست، یکی از این سیستمها را برای استفاده در سلولهای انسانی بهینه کردهاند. این سیستم که evoCAST نام دارد، میتواند تا ۱۵٬۰۰۰ باز DNA را در سلولهای انسانی درج کند، از جمله در چندین محل مرتبط با درمان در ژنوم3.
اما برخی طرحهای evoCAST شامل شش یا هفت پروتئین هستند — باری سنگین برای روشهای تحویل کنونی. استرنبرگ میگوید: «یک تمرکز بزرگ، سادهسازی تعداد اجزا به کمترین مولکولهای ممکن و کار روی روشهای متفاوت برای تحویل آنها بوده است.»
.
در مقابل، میلر به «نوترکیبسازی» روی آورده است — تکنیکی مبتنی بر نوترکیبی ژنتیکی که برای بازنویسی ژنوم باکتریها به کار میرود. سیستم او با حدود ۱٬۵۰۰ جفتباز (بدون احتساب DNA اهداکننده) میتواند بسته به اندازه DNA اهداکننده در یک ژنوم AAV واحد جای گیرد4. میلر و همکارانش در تلاشند کارایی این سیستم را در سلولهای انسانی افزایش دهند.
دسته دیگری از عناصر ژنتیکی متحرک به نام رتروترانسپوزونهای R2 میتوانند کاملاً بهصورت مولکولهای RNA بستهبندیشده درون یک نانوذره لیپیدی تحویل شوند، که میتواند محمولههای بسیار بزرگتری از AAVها را حمل کند.
اما هدفگیری رتروترانسپوزونها به مناطق متمایز ژنوم نیازمند مهندسی مجدد دامنه اتصال به DNA رتروترانسپوزون است — کاری بسیار چالشبرانگیزتر از تغییر یک RNA راهنما. در نتیجه، پژوهشگران معمولاً DNA اهداکننده را در ناحیه «بندر امن» از پیش تعیینشدهای از ژنوم میدوزند که بعید است آسیبی وارد کند.