خلاصه: در راستای تلاش‌های ما برای آزمایش چگونگی کمک کلود به تسریع کشف دارو، از یک مدل تحقیقاتی داخلی خواستیم مینی‌بایندرهای (پروتئین‌های کوچکی که محکم به هدف متصل می‌شوند) ضد نوروتوکسین‌های عقرب را طراحی کند. کلود بر اساس دستور اولیه ما و چهار پیگیری که در همکاری با شرکت تحقیقات سرمایه‌گذاری مالی «سیتینی ریسرچ» توسعه دادیم، کار کرد. تیم‌های مستقر در «ادپتیو بیو» و «تویست بیوساینس» ۲۱۱ طرح را از نظر اتصال به طور آزمایشگاهی تست کردند. از این میان، ۱۷ مورد معیارهای ما را برآورده کردند. ما تمام ۲۱۱ طرح و داده‌های آن‌ها را به عنوان منبعی برای این حوزه منتشر می‌کنیم.
در ماه اوت، نشان دادیم که چگونه کلود پس از دریافت یک دستور واحد، مینی‌بایندرهای پروتئینی را طراحی کرد. یک ماه قبل از انتشار آن نتایج، تیمی از سیتینی ریسرچ با سوال جالبی به سراغ ما آمد: آیا کلود (و به طور کلی کشف دارو با هوش مصنوعی) می‌تواند به گروهی از افراد غیرمتخصص اما انگیزه‌مند امکان دهد تا مسئله‌ای واقعی در سلامت انسان را حل کنند؟ اعضای تیم تحقیقات علوم زیستی ما تصمیم گرفتند به این سوال پاسخ دهند و ابتدا با طوفان فکری همراه با کلود شروع به کار کردند. ما به این نتیجه رسیدیم که از کلود بخواهیم در طراحی بایندرهای پروتئینی جدید علیه نوروتوکسین‌های عقرب کمک کند، با امید روزی که بتوان از آن‌ها برای توسعه پادزهر عقرب استفاده کرد.
عقرب‌ها سالانه بیش از ۱.۲ میلیون نفر را نیش می‌زنند که منجر به بیش از ۳,۲۵۰ مرگ می‌شود، عمدتاً در کودکان در بخش‌هایی از جهان که دسترسی محدودی به مراقبت‌های پزشکی دارند. درمان‌های جدید گران هستند و همچنین بعید است هزینه توسعه آن‌ها بازگشت داشته باشد. با توجه به سرمایه‌گذاری اندک، مسمومیت ناشی از نیش عقرب به عنوان یک بیماری گرمسیری غفلت‌شده توصیف شده است.
ما کار را با دادن همان دستوری که در مطالعه قبلی بایندر پروتئینی استفاده کرده بودیم، پس از اصلاح آن با کمک سیتینی، به کلود آغاز کردیم.1 در طول ۶۴ ساعت بعد، یک مدل تحقیقاتی داخلی که در محیط «کلود ساینس» عمل می‌کرد، عمدتاً به صورت خودمختار کار کرد، اگرچه ما با چهار پیگیری کار او را هدایت کردیم. تحت نظارت ما، کلود داده‌های تحقیقاتی را تحلیل کرد، تصاویر را تولید کرد و گزارش نهایی را پیش‌نویس نمود.
کمپین طراحی کلود ۱۷ بایندر پروتئینی تولید کرد که هر کدام به یکی از چهار نوروتوکسین عقرب شناخته شده به عنوان خطرناک برای انسان متصل می‌شدند. در کل فرآیند، کلود ۳۱۸,۴۸۴ طرح پروتئینی تولید کرد و ۱۸۰ مورد از آن‌ها را برای آزمایش انتخاب نمود. تیم ما با کمک کلود ۳۱ مورد دیگر اضافه کرد. شرکای ما در «ادپتیو بیو» و «تویست بیوساینس»، دو سازمان تحقیقاتی قراردادی (CRO)، تمام ۲۱۱ طرح را در آزمایشگاه تست کردند تا ببینند آیا به سمومی که علیه آن‌ها طراحی شده بودند متصل می‌شوند یا خیر، و ۱۷ طرح معیارهای ما برای یک بایندر را داشتند. ما تأیید نکرده‌ایم که آیا این بایندرها سم عقرب را در محیط سلولی خنثی می‌کنند، بنابراین مدعی تولید پادزهر نیستیم.
ما کار کلود را برای دو متخصص خارجی، سوزانا واسکز تورس و تیموتی پی. جنکینز، ارسال کردیم که گفتند این کار را یک قدم اول امیدوارکننده می‌دانند. اگر هوش مصنوعی اکنون بتواند در عرض چند روز بایندرهای قابل اعتماد علیه چندین سم دشوارِ هدف‌گیری طراحی کند و آن‌ها در عرض چند هفته در آزمایشگاه تأیید شوند، این می‌تواند به طور نظری کشف دارو برای مسمومیت‌ها و سایر بیماری‌های غفلت‌شده را تسریع بخشد. چالش همیشگی، تبدیل این بایندرها به داروهای ایمن، مقرون‌به‌صرفه و در دسترس گسترده است.
جزئیات بیشتر را در گزارش فنی خود ارائه می‌دهیم و تمام ۲۱۱ طرح و داده‌های آن‌ها را در دسترس قرار می‌دهیم.
طراحی یک بایندر علیه تقریباً هر هدفی دیگر غیرواقعی به نظر نمی‌رسد. اکنون می‌توانیم بایندرهای بسیار محکم را با سرعت شگفت‌انگیزی به دست آوریم و خودِ اتصال دیگر گلوگاه اصلی نیست. برای حیوانات سمی مانند مارها و عقرب‌ها که نیش و گاز آن‌ها تعداد زیادی از مردم را می‌کشد یا زخمی می‌کند، به ویژه در مناطق کم‌برخوردار، تأثیر واقعی از رفع مشکلاتی در خط لوله درمانی فراتر از اتصال خواهد آمد. چالش این است که از این ابزارهای فوق‌العاده برای توسعه مولکول‌هایی استفاده کنیم که بتوانند به داروهای واقعی تبدیل شوند؛ داروهایی که ایمن، مقرون‌به‌صرفه و در دسترس گسترده باشند.
سوزانا واسکز تورس، پژوهشگر پسادکتری، برنامه زیست‌شناسی ساختاری، مرکز ملی تحقیقات سرطان اسپانیا (CNIO)، مادرید، اسپانیا.
طراحی بایندرهای de novo علیه پنج سم از چهار گونه عقرب
سم عقرب حاوی چندین نوروتوکسین پروتئینی است. نوروتوکسین‌هایی که احتمال آسیب رساندن یا کشتن انسان را دارند، به کانال‌های سدیمی متصل می‌شوند؛ پروتئین‌های بزرگ تعبیه‌شده در غشای سلول‌های عصبی که به آن‌ها اجازه شلیک می‌دهند. وقتی کانال‌های سدیمی مختل می‌شوند، اعصاب در زمان نامناسب شلیک می‌کنند—این امر باعث آزادسازی مقادیر زیاد مواد شیمیایی استرس‌زا، مانند آدرنالین می‌شود. در موارد شدید، این می‌تواند باعث نارسایی قلبی و تجمع مایع اضافی در ریه‌ها شود و گاهی منجر به مرگ گردد.
برخی پادزهرها برای نیش عقرب موجود است. آن‌ها معمولاً با استفاده از آنتی‌بادی‌های حیوانات ایمونیزه‌شده ساخته می‌شوند، فرآیندی که ممکن است ماه‌ها طول بکشد. سم از هزاران عقرب دوشیده می‌شود و برای ایمونیزه کردن اسب‌ها استفاده می‌شود؛ سپس دانشمندان آنتی‌بادی‌های حاصل را از خون اسب‌ها خالص‌سازی می‌کنند. پادزهرهای سنتی اگر زود تجویز شوند می‌توانند موثر باشند، اما معمولاً فقط علیه تعداد کمی از نوروتوکسین‌ها اثرگذارند. همچنین تولید آن‌ها گران است و در بسیاری از مناطق هزینه بالا یا کمبود عرضه دارند.
طراحی de novo راه‌حل بالقوه‌ای ارائه می‌دهد. یک بایندر مولکولی است که محکم به یک هدف خاص متصل می‌شود؛ آنتی‌بادی‌ها یک مثال طبیعی هستند. به طور اصولی، یک بایندر که بخشی از نوروتوکسین را که به کانال سدیمی متصل می‌شود هدف قرار دهد، می‌تواند از رسیدن سم به کانال جلوگیری کند. در طراحی de novo، بایندرهای پروتئینی از صفر و علیه یک هدف خاص تولید می‌شوند. این بایندرها به صورت محاسباتی طراحی می‌شوند و می‌توانند برای ویژگی‌های شبیه دارو مانند قدرت و پایداری بهینه شوند، که ممکن است توزیع آن‌ها را در مناطقی که نیش عقرب بیشتر رخ می‌دهد آسان‌تر کند.
رویکرد ما از تلاش قبلی الهام گرفته شد که پروتئین‌های de novo را طراحی کرد که نوروتوکسین‌های مار را خنثی کردند و از موش‌ها محافظت نمودند. تا جایی که ما می‌دانیم، هیچ بایندر طراحی‌شده de novo علیه نوروتوکسین‌های عقرب گزارش نشده است.
برای این کمپین، ما انتخاب کردیم پنج نوروتوکسین سم عقرب را در چهار منطقه هدف قرار دهیم: مکزیک (Cn2)، برزیل (Ts1)، شمال آفریقا (AaH I و AaH II)، و خاورمیانه (LqhIII). همچنین تصمیم گرفتیم طرح‌ها را به محل اتصال کانال هر سم هدف بگیریم. کلود ساختارهای سمی را که برای طراحی استفاده می‌شد، با جستجو در بانک داده پروتئین (PDB) و پایگاه داده آلفا فولد (AFDB) انتخاب کرد. برای هر سم، پنج هات‌اسپات (نقاط داغ) را انتخاب کرد؛ موقعیت‌های خاص اسید آمینه روی سم که طرح‌های بایندر باید به آن‌ها متصل می‌شدند.
ما عمدتاً کنجکاو بودیم که آیا کلود می‌تواند بایندرهای علیه سم‌های منفرد طراحی کند. اما همچنین کنجکاو بودیم که آیا کلود می‌تواند بایندرهای هدف‌گیرنده چندین سم را طراحی کند. دلیل عملی برای تلاش جهت طراحی بایندرهای چندسمی این است که تعداد مولکول‌های مورد نیاز برای یک کوکتل پادزهر جهانی کاهش می‌یابد—که مقرون‌به‌صرفه‌ترین و منطقه‌خنثی‌ترین درمان خواهد بود. ما این پنج سم عقرب (Cn2، Ts1، AaH I، AaH II و LqhIII) را به عنوان یک چالش برای طراحی چندسمی انتخاب کردیم: آن‌ها یک تا (fold) کلی برای شکل پروتئین مشترک دارند، اما هر دو مورد تنها بین ۲۶٪ تا ۶۲٪ در توالی‌های اسید آمینه خود مشابهت دارند.
برای دیدن اینکه کلود تا چه حد می‌تواند پیش برود، از او خواستیم چهار نوع بایندر طراحی کند: بایندرهای علیه هر یک از پنج سم به صورت جداگانه؛ بایندرهای هدف‌گیرنده سم‌های خانواده بتا Ts1 و Cn2؛ بایندرهای هدف‌گیرنده سم‌های خانواده آلفا AaH II، AaH I و LqhIII؛ و بایندرهای هدف‌گیرنده هر پنج سم به صورت همزمان.
طراحی بایندرهای قابل اعتماد علیه پنج سم به صورت موازی، در عرض چند روز، نمایش عالی از تغییر پارادایم مبتنی بر هوش مصنوعی است که در کشف درمان مشاهده می‌کنیم. این موضوع به ویژه برای بیماری‌های غفلت‌شده مانند مسمومیت‌های حیوانی صادق است که به دلیل مشوق‌های تجاری پایین، عملاً از نوآوری محروم مانده‌اند. توانایی مقابله عامل‌محور با فضای هدف به شدت گسترده در سموم حیوانی، سرعت کشف را به طور قابل توجهی افزایش می‌دهد و راه‌حل‌های درمانی واقع‌بینانه را بسیار نزدیک‌تر می‌کند.
تیموتی پی. جنکینز، استاد انجمن، دانشگاه فنی دانمارک.
کلود کمپین طراحی را با استقلال قابل توجه اجرا کرد
دستور اولیه ما اهداف نوروتوکسین، ابزارهای طراحی و تا شدن پروتئین، و قوانین مربوط به نوآوری، امتیازدهی و فیلتر کردن را تعریف کرد. فراتر از انتخاب ساختارها و نقاط داغ اسید آمینه، کلود همچنین آستانه‌های کیفیتی که یک طرح باید از آن‌ها عبور کند را تعیین کرد، تصمیم گرفت چقدر از هر ابزار طراحی موجود استفاده کند، و استراتژی‌هایی برای طراحی بایندرهای علیه چندین سم توسعه داد.
در نهایت، کلود از ۱۲ ابزار طراحی برای تولید ۳۱۸,۴۸۴ طرح استفاده کرد و هر طرحی که شبیه به یک سم یا پروتئین شناخته‌شده بود را حذف نمود. کلود ۵۵۳,۰۵۲ جفت طرح-سم را به صورت همزمان تا کرد و غربالگری نمود و ساختار هر جفت را به عنوان یک کمپلکس پیش‌بینی کرد. شصت و چهار ساعت پس از ارائه دستور اولیه به کلود، او لیست نهایی ۱۸۰ طرح را تولید کرد. این کمپین حدود ۱۰,۰۰۰ ساعت GPU مصرف کرد.2
کلود پس از دستور اول ما به مدت ۲۴ ساعت به صورت خودمختار کار کرد. نتایج او ما را تشویق کرد تا از کلود بخواهیم کمپین خود را ادامه دهد و به دنبال طرح‌های بهتر باشد. دستورات پیگیری ما عمدتاً بر هدایت کلود برای طراحی یک بایندر چندسمی متمرکز بود. کلود اکثر ۱۸۰ طرح را—از جمله قوی‌ترین بایندر ما (Cn2-B1)—تنها پس از سومین پیگیری ما انتخاب کرد. طبق درخواست ما، کلود توالی‌های پروتئینی را به «تویست بیوساینس» ارسال کرد (در ایمیل‌هایی که نشان می‌داد توسط کلود نوشته شده‌اند)، که پروتئین‌ها را تولید کرد تا ببیند چقدر خوب به سموم متصل می‌شوند. ما بعداً با کلود کار کردیم تا ۳۱ طرح دیگر اضافه کنیم و مجموع را به ۲۱۱ طرح افزایش دهیم: ۶۰ طرح علیه یک سم منفرد (۱۲ طرح برای هر سم)، ۳۰ طرح علیه دو سم خانواده بتا، ۳۰ طرح علیه سه سم خانواده آلفا، و ۹۱ طرح علیه هر پنج سم.
از ۲۱۱ طرحی که تیم‌های ما ارزیابی کردند، ۱۷ مورد معیارهای ما برای یک بایندر را داشتند، هر کدام علیه یک سم منفرد. هیچ‌یک از طرح‌های تهیه‌شده علیه چندین سم، معیارهای ما را برای بیش از یک سم برآورده نکرد. (فراتر از محدودیت‌های توانایی‌های فعلی، توضیحات متعددی برای اینکه چرا کلود در این زمینه مشکل داشت وجود دارد، از جمله نحوه دستوردهی ما، محدودیت‌های ابزارهای طراحی موجود، و حتی امکان‌پذیری بیولوژیکی طراحی چندسمی.) هفت طرح بایندر علیه Cn2 بودند، چهار طرح علیه AaH II، چهار طرح علیه AaH I، و دو طرح علیه LqhIII. از میان ۶۰ طرح تک‌سمی، ۱۱ مورد بایندر بودند (۱۸٪). این نرخ با کمپین‌های معمول طراحی پروتئین، از جمله کار قبلی ما، سازگار است.
آزمایش طرح‌های کلود در آزمایشگاه
پس از اتمام کمپین، ما طرح‌ها را برای آزمایش اتصال به «ادپتیو بیو» و «تویست بیوساینس» ارسال کردیم. هر گروه طرح‌ها را در آزمایشگاه‌های خود تولید کرد، اما در قالب‌های متفاوت. «ادپتیو بیو» آن‌ها را در یک سیستم بدون سلول بیان کرد، که از ماشین‌آلات تولید پروتئین استخراج‌شده از باکتری‌ها به جای سلول‌های زنده استفاده می‌کند. «تویست بیوساینس» طرح‌ها را در سلول‌های پستانداران (در این مورد، سلول‌های کلیه انسان) به صورت فیوژن با Fc (دم آنتی‌بادی) بیان کرد. این‌ها روش‌های مکمل برای اندازه‌گیری فرآیند اتصال پایه هستند و ما آن‌ها را ترکیب کردیم تا به اطمینان از نتایج خود بیفزاییم.
هر دو آزمایشگاه اتصال را با رزونانس پلاسمون سطحی (SPR) اندازه‌گیری کردند، که در آن یک سم روی طرح جریان می‌یابد و دستگاه SPR به صورت بلادرنگ ردیابی می‌کند که چقدر سریع سم به طرح متصل و از آن جدا می‌شود. ردیاب حاصل، که سنسوگرام نامیده می‌شود، اندازه‌گیری‌ای به نام ثابت تفکیک (KD) تولید می‌کند، که معیاری برای قدرت اتصال (یا افینیتی) است. هرچه KD کمتر باشد، اتصال محکم‌تر است.
وقتی صحبت از ارزیابی طرح‌های حاصل شد، ما معیارهای سخت‌گیرانه‌ای برای برچسب زدن یک طرح به عنوان بایندر علیه یک سم تعیین کردیم. طرح باید در هر دو آزمایشگاه هیت (Hit) باشد3—یعنی باید شواهد اتصال علیه آن سم را در هر تکرار نشان دهد و هر KD باید ۱ میکرومولار یا کمتر باشد. همچنین الزام داشتیم که طرح سیگنالی علیه CLEC12A، یک پروتئین بی‌ربط انسانی که برای اندازه‌گیری اتصال خارج از هدف یا «چسبندگی» استفاده می‌شود، نشان ندهد.
بایندرهای Cn2 کلود احتمالاً به همان محل یک آنتی‌بادی خنثی‌کننده سم متصل می‌شوند
آنتی‌بادی‌ها و نانوبادی‌ها همچنان استاندارد طلایی برای شکست دادن طرح‌های de novo هستند. سه مولکول چنینی افینیتی (KD) زیر ۱ نانو مولار علیه Cn2 یا AaH II گزارش کرده‌اند و نشان داده شده که از موش‌ها در برابر سموم عقرب محافظت می‌کنند.
دو بایندر قوی ما، که آن‌ها را Cn2-B1 و Cn2-B2 می‌نامیم، Cn2 را هدف قرار می‌دهند؛ یک نوروتوکسین از عقرب مکزیکی Centruroides noxius. هر دو در «ادپتیو بیو» و «تویست بیوساینس» محکم به Cn2 متصل شدند، با افینیتی (KD) در محدوده نانو مولار تک‌رقمی.
یکی از راه‌های یافتن اینکه آیا دو مولکول (مثلاً یک آنتی‌بادی و یک مینی‌پروتئین) به همان محل روی یک هدف متصل می‌شوند، استفاده از یک آزمایش رقابتی است، که بررسی می‌کند آیا هر دو بایندر می‌توانند همزمان به هدف متصل شوند یا خیر. اگر حضور یک مولکول اتصال مولکول دیگر را کاهش دهد، احتمالاً آن‌ها برای همان محل اتصال رقابت می‌کنند.
آزمایش‌های رقابتی ما پیشنهاد می‌کند که بایندرهای Cn2 ما هر کدام روی یا نزدیک همان اپیتوپ (محل اتصال) یک آنتی‌بادی به نام LR متصل می‌شوند، که گزارش شده است Cn2 را در موش‌ها خنثی می‌کند. محل اتصال LR بخشی از Cn2 را پوشش می‌دهد که به کانال سدیمی متصل شده و باعث شلیک نادرست اعصاب می‌شود. ما قوی‌ترین بایندرهای خود، Cn2-B1 و Cn2-B2، را در محیط سلولی یا در حیوانات زنده آزمایش نکرده‌ایم، اما واقعیت اینکه آن‌ها با LR رقابت می‌کنند، نشان می‌دهد که احتمالاً Cn2 را خنثی خواهند کرد.
یک بایندر تنها اولین قدم برای توسعه پادزهر است
نتایج ما فقط اتصال علیه سم‌های نوترکیب را نشان می‌دهد، که در آزمایشگاه از ژن هر سم رشد می‌کنند نه از سم خالص‌سازی‌شده. دو محدودیت بزرگ این مطالعه این است که ما هیچ طرحی را برای خنثی‌سازی in vitro (علیه سلول‌های پرورش‌یافته در آزمایشگاه) یا اثربخشی in vivo (در حیوانات زنده، مانند موش‌ها) آزمایش نکردیم.
اگر بخواهیم یک طرح را به سمت درمان پیش ببریم، Cn2-B1 یکی از قوی‌ترین کاندیداهای ما خواهد بود. اما ابتدا، باید تأیید کنیم که طرح همچنین به سم خالص‌سازی‌شده از زهر متصل می‌شود. سپس آن را برای عملکرد in vitro با ضبط‌های پچ‌کلمپ (که می‌توانند جریان الکتریکی عبوری از کانال‌های سدیمی را اندازه‌گیری کنند) ارزیابی خواهیم کرد تا ببینیم آیا از عمل سم روی کانال جلوگیری می‌کند. پس از آن، باید بایندر را در موش‌ها آزمایش کنیم تا ببینیم آیا واقعاً از آن‌ها محافظت می‌کند. فراتر از خنثی‌سازی سم، یک درمان باید ایمن، پایدار، مقرون‌به‌صرفه و در دسترس جایی که نیش رخ می‌دهد باشد. رسیدن به بیماران نیز نیازمند همکاری بالینی‌گران، سرمایه‌گذاران و سیاست‌گذاران است.
ما تمام ۲۱۱ طرح و داده‌های اتصال آن‌ها را منتشر می‌کنیم تا سایر محققان بتوانند بر کار ما بنا کنند. امیدواریم این نمایش توانایی‌های کلود، همراه با داده‌هایی که منتشر می‌کنیم، به تسریع تحقیقات بیشتر در طراحی پادزهر کمک کند.
مطالعات بیشتر
منابع زیر عمق فنی بیشتر و اطلاعات دقیق‌تری درباره نتایج ذکر شده در بالا ارائه می‌دهند:
- گزارش فنی؛
- انتشار داده‌ها: تمام ۲۱۱ طرح، ساختارهای پیش‌بینی‌شده و امتیازات آن‌ها، و داده‌های آزمایشگاهی؛
- پست‌های قبلی ما درباره طراحی پروتئین و ارتقای مدل‌سازی زیست‌مولکولی.